在生命科學(xué)研究領(lǐng)域，細(xì)胞和微生物的培養(yǎng)是探索生命奧秘、攻克疾病難題的重要基礎(chǔ)。而培養(yǎng)環(huán)境的精確控制，直接關(guān)系到培養(yǎng)對(duì)象的生長(zhǎng)狀態(tài)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的三氣培養(yǎng)箱憑借其能夠精準(zhǔn)調(diào)控氧氣、二氧化碳和氮?dú)鉂舛?，同時(shí)維持穩(wěn)定溫度和濕度的特性，成為科研實(shí)驗(yàn)中不可或缺的關(guān)鍵設(shè)備。本實(shí)驗(yàn)將通過(guò)開(kāi)展腫瘤細(xì)胞低氧培養(yǎng)和厭氧微生物培養(yǎng)兩項(xiàng)研究，探究三氣培養(yǎng)箱在不同科研場(chǎng)景下的實(shí)際應(yīng)用效果。

一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

1、利用三氣培養(yǎng)箱模擬腫瘤組織低氧微環(huán)境，研究低氧條件對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及相關(guān)基因表達(dá)的影響，為腫瘤的發(fā)病機(jī)制研究和靶向治療提供理論依據(jù)。

2、借助三氣培養(yǎng)箱創(chuàng)建厭氧環(huán)境，實(shí)現(xiàn)厭氧微生物的分離培養(yǎng)與特性研究，探索厭氧微生物在生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和生物技術(shù)領(lǐng)域的潛在應(yīng)用價(jià)值。

二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

（一） 實(shí)驗(yàn)材料

1、細(xì)胞與微生物：

人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，購(gòu)自細(xì)胞庫(kù)，復(fù)蘇后在常規(guī)條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

厭氧微生物樣本，采集自湖泊底泥，保存于厭氧運(yùn)輸管中。

2、試劑：

細(xì)胞培養(yǎng)：RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗、胰蛋白酶、低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）抗體、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）抗體。

微生物培養(yǎng)：厭氧培養(yǎng)基（含酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖等成分）、刃天青指示劑（用于檢測(cè)厭氧環(huán)境）、無(wú)菌生理鹽水。

3、儀器：三氣培養(yǎng)箱（可精確調(diào)控O?、CO?、N?濃度，溫度控制范圍為4℃-60℃，濕度≥90%）、倒置顯微鏡、高速冷凍離心機(jī)、熒光定量PCR儀、蛋白免疫印跡（Western Blot）相關(guān)設(shè)備、厭氧手套箱（輔助厭氧微生物操作）。

（二） 樣本分組與處理

1、腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：

常氧組：將A549細(xì)胞接種于含10%胎牛血清和1%雙抗的 RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于三氣培養(yǎng)箱，設(shè)置環(huán)境條件為21% O?、5% CO?、74% N?，37℃，濕度≥90%，每組設(shè)置6個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

低氧組：同樣接種A549細(xì)胞，培養(yǎng)基成分相同，但將三氣培養(yǎng)箱環(huán)境條件調(diào)整為1% O?、5% CO?、94% N?，37℃，濕度≥90%，每組設(shè)置6個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

2、厭氧微生物實(shí)驗(yàn)：

將采集的湖泊底泥樣本用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)謩e取10?2、10?3、10??稀釋度的菌液各0.1mL，均勻涂布于厭氧培養(yǎng)基平板上。

將涂布后的平板放入三氣培養(yǎng)箱，設(shè)置環(huán)境條件為0% O?、5% CO?、95% N?，35℃，濕度≥90%，每組平板設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)；同時(shí)設(shè)置需氧對(duì)照平板，放置于普通二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

三、實(shí)驗(yàn)操作步驟

（一） 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)與檢測(cè)

1、細(xì)胞接種與培養(yǎng)：

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×10?個(gè)/mL，分別接種于上述兩組培養(yǎng)條件的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入2mL細(xì)胞懸液。

培養(yǎng)24小時(shí)后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照記錄；之后每隔24小時(shí)，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)胞數(shù)量，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

2、基因表達(dá)檢測(cè)：

培養(yǎng)72小時(shí)后，收集兩組細(xì)胞，按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

利用熒光定量PCR儀，以β- actin為內(nèi)參基因，檢測(cè)HIF-1α、PCNA、MMP-2等基因的表達(dá)水平，分析低氧條件對(duì)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響。

3、蛋白表達(dá)檢測(cè)：

另取培養(yǎng)72小時(shí)的細(xì)胞，提取總蛋白，采用Western Blot技術(shù)檢測(cè) HIF-1α、PCNA、MMP-2蛋白的表達(dá)量，探究低氧環(huán)境下蛋白水平的變化。

（二） 厭氧微生物培養(yǎng)與鑒定

1、培養(yǎng)過(guò)程：

將涂布好的厭氧培養(yǎng)基平板放入三氣培養(yǎng)箱后，通過(guò)觀察刃天青指示劑顏色變化確認(rèn)厭氧環(huán)境建立情況（無(wú)氧時(shí)指示劑由藍(lán)色變?yōu)闊o(wú)色）。

培養(yǎng)5-7天后，觀察厭氧微生物在平板上的菌落形態(tài)、顏色、大小等特征，并與需氧對(duì)照平板進(jìn)行對(duì)比。

2、微生物分離與鑒定：

挑選厭氧平板上不同形態(tài)的單菌落，采用劃線分離法進(jìn)行純化，重復(fù)3-4次直至獲得純培養(yǎng)物。

對(duì)純化后的厭氧微生物進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增與測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，鑒定微生物種類(lèi)。

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

（一） 腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、細(xì)胞形態(tài)與增殖：

常氧組細(xì)胞呈梭形，貼壁生長(zhǎng)良好，細(xì)胞間連接緊密；低氧組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，部分細(xì)胞變圓，貼壁能力減弱。

細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示，低氧組細(xì)胞增殖速率明顯低于常氧組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）。

2、基因與蛋白表達(dá)：

熒光定量 PCR 結(jié)果表明，低氧組HIF-1α、MMP-2基因表達(dá)水平顯著高于常氧組（P< 0.01），而 PCNA 基因表達(dá)量降低（P<0.05）。

Western Blot 檢測(cè)結(jié)果與基因表達(dá)趨勢(shì)一致，低氧組HIF-1α、MMP-2蛋白表達(dá)上調(diào)，PCNA蛋白表達(dá)下調(diào)。

（二）厭氧微生物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、培養(yǎng)與分離：

三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的厭氧平板上，成功生長(zhǎng)出多種形態(tài)的菌落，而需氧對(duì)照平板上幾乎無(wú)菌落生長(zhǎng)，表明三氣培養(yǎng)箱創(chuàng)建的厭氧環(huán)境滿(mǎn)足微生物生長(zhǎng)需求。

經(jīng)劃線分離，共獲得5株純培養(yǎng)的厭氧微生物。

2、鑒定結(jié)果：

16S rRNA基因測(cè)序比對(duì)顯示，5株厭氧微生物分別屬于擬桿菌屬（Bacteroides）、梭菌屬（Clostridium）等不同的分類(lèi)單元，為后續(xù)深入研究其功能特性奠定基礎(chǔ)。

五、實(shí)驗(yàn)結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)腫瘤細(xì)胞低氧培養(yǎng)和厭氧微生物培養(yǎng)兩項(xiàng)研究，充分驗(yàn)證了博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的三氣培養(yǎng)箱在科研實(shí)驗(yàn)中的重要作用和應(yīng)用價(jià)值。在腫瘤細(xì)胞研究方面，博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的三氣培養(yǎng)箱能夠精準(zhǔn)模擬低氧微環(huán)境，顯著影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移及相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，為腫瘤生物學(xué)研究提供了可靠的實(shí)驗(yàn)條件。在厭氧微生物培養(yǎng)中，博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的三氣培養(yǎng)箱可有效創(chuàng)建穩(wěn)定的厭氧環(huán)境，實(shí)現(xiàn)厭氧微生物的分離培養(yǎng)與鑒定，有助于挖掘厭氧微生物資源的潛在應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的三氣培養(yǎng)箱憑借其精確的氣體濃度調(diào)控、穩(wěn)定的溫度和濕度控制，能夠滿(mǎn)足多種科研實(shí)驗(yàn)需求，是開(kāi)展生命科學(xué)研究的重要技術(shù)支撐。未來(lái)可進(jìn)一步拓展三氣培養(yǎng)箱在其他特殊培養(yǎng)條件下的應(yīng)用，探索其在更廣泛科研領(lǐng)域的潛在價(jià)值。