在科研實(shí)驗(yàn)的微觀世界里，水質(zhì)的細(xì)微差異都可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生重大影響。博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的超純水機(jī)作為科研實(shí)驗(yàn)室獲取高純度水的核心設(shè)備，其產(chǎn)出水質(zhì)的優(yōu)劣直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性與可靠性。本實(shí)驗(yàn)旨在通過對(duì)比不同水質(zhì)在細(xì)胞培養(yǎng)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用效果，驗(yàn)證超純水機(jī)產(chǎn)出的超純水對(duì)保障實(shí)驗(yàn)成功的重要意義。

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

探究超純水機(jī)產(chǎn)出的超純水與普通蒸餾水、市售純凈水在細(xì)胞培養(yǎng)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的實(shí)際應(yīng)用效果差異，明確超純水在維持細(xì)胞活性、保證核酸提取純度及PCR反應(yīng)準(zhǔn)確性等方面的關(guān)鍵作用，為科研實(shí)驗(yàn)用水選擇提供科學(xué)依據(jù)。

二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

（一） 實(shí)驗(yàn)材料

1、水樣：

超純水：由實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)制備，電阻率≥18.25MΩ?cm，TOC（總有機(jī)碳）＜10 μg/L 。

普通蒸餾水：實(shí)驗(yàn)室常規(guī)蒸餾設(shè)備制備。

市售純凈水：購買知名品牌飲用純凈水。

2、細(xì)胞系：人胚腎細(xì)胞系293T，購自細(xì)胞庫，復(fù)蘇后在常規(guī)條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期。

3、試劑：

細(xì)胞培養(yǎng)：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗、胰蛋白酶。

分子生物學(xué)：RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光定量PCR預(yù)混試劑、引物（針對(duì)β-actin基因設(shè)計(jì)）。

4、儀器：超純水機(jī)、二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、高速冷凍離心機(jī)、熒光定量PCR儀、微量分光光度計(jì)、恒溫?fù)u床。

（二） 樣本分組與處理

1、細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：將293T細(xì)胞均勻分為3組，分別使用含超純水、普通蒸餾水、市售純凈水配制的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每組設(shè)置6個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種于一個(gè)6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。

2、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)：同樣將實(shí)驗(yàn)分為3組，分別使用3種不同水樣參與RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)過程，每組準(zhǔn)備3份相同的組織樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

三、實(shí)驗(yàn)操作步驟

（一） 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

1、培養(yǎng)基配制：

超純水處理組：使用超純水按照說明書配制DMEM培養(yǎng)基，加入10%胎牛血清和1%雙抗。

普通蒸餾水處理組：以普通蒸餾水替代超純水，其他成分和操作相同。

市售純凈水處理組：用市售純凈水配制培養(yǎng)基，操作同上。

2、細(xì)胞接種與培養(yǎng)：將處于對(duì)數(shù)生長期的293T細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×10?個(gè)/mL，分別接種于上述3組培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO?的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3、觀察與檢測：在培養(yǎng)后的第1天、3天、5天，使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，拍照記錄；并通過細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定細(xì)胞密度，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

（二） 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

1、RNA 提取：分別使用3種水樣配制洗滌緩沖液等試劑，按照RNA提取試劑盒說明書，從組織樣本中提取RNA。提取完成后，用微量分光光度計(jì)測定RNA濃度和純度（檢測OD???/OD???比值）。

2、反轉(zhuǎn)錄：以提取的RNA為模板，使用對(duì)應(yīng)水樣配制反應(yīng)體系，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

3、熒光定量PCR：利用cDNA為模板，以不同水樣配制PCR反應(yīng)體系，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，設(shè)置反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，40個(gè)循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析，檢測PCR產(chǎn)物特異性。

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

（一） 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、細(xì)胞形態(tài)觀察：培養(yǎng)1天后，超純水處理組細(xì)胞貼壁良好，形態(tài)均一，呈梭形；普通蒸餾水處理組部分細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，形態(tài)不規(guī)則；市售純凈水處理組細(xì)胞貼壁率較低，細(xì)胞間存在較多碎片。培養(yǎng)5天后，超純水處理組細(xì)胞增殖旺盛，鋪滿孔底；普通蒸餾水處理組細(xì)胞增殖緩慢，且出現(xiàn)大量死亡細(xì)胞；市售純凈水處理組細(xì)胞幾乎停止生長，死亡細(xì)胞占比超過60%。

2、細(xì)胞增殖率計(jì)算：繪制細(xì)胞增殖曲線，超純水處理組細(xì)胞在5天內(nèi)的平均增殖率達(dá)到300%，普通蒸餾水處理組僅為120%，市售純凈水處理組為50%。通過單因素方差分析，三組細(xì)胞增殖率差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。

（二） 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、RNA提取質(zhì)量：超純水處理組提取的RNA平均濃度為1.2μg/μL，OD???/OD???比值為1.95；普通蒸餾水處理組RNA濃度為0.8μg/μL，比值為1.75；市售純凈水處理組RNA濃度為0.6μg/μL，比值為1.60。超純水處理組RNA純度和濃度顯著高于其他兩組（P<0.05）。

2、熒光定量PCR結(jié)果：超純水處理組PCR產(chǎn)物的Ct值穩(wěn)定，熔解曲線單一，表明擴(kuò)增特異性良好；普通蒸餾水處理組部分樣本出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶，Ct值波動(dòng)較大；市售純凈水處理組PCR反應(yīng)效率低，部分樣本未檢測到擴(kuò)增產(chǎn)物。

五、實(shí)驗(yàn)結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)比超純水、普通蒸餾水和市售純凈水在細(xì)胞培養(yǎng)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用效果，充分驗(yàn)證了博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的超純水機(jī)產(chǎn)出的超純水在科研實(shí)驗(yàn)中的重要價(jià)值。在細(xì)胞培養(yǎng)中，超純水能夠?yàn)榧?xì)胞提供更適宜的生長環(huán)境，顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，維持細(xì)胞正常形態(tài)和活性；在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)里，超純水有助于獲得更高純度和濃度的核酸，保障PCR等反應(yīng)的準(zhǔn)確性和特異性。普通蒸餾水和市售純凈水因含有雜質(zhì)、微生物或有機(jī)物，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生明顯干擾。因此，在科研實(shí)驗(yàn)中，尤其是對(duì)水質(zhì)要求嚴(yán)苛的細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)等實(shí)驗(yàn)，使用博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的超純水機(jī)制備的超純水是確保實(shí)驗(yàn)成功、數(shù)據(jù)可靠的關(guān)鍵因素。后續(xù)研究可進(jìn)一步拓展超純水在其他科研領(lǐng)域的應(yīng)用效果驗(yàn)證，探索超純水質(zhì)量對(duì)不同類型實(shí)驗(yàn)的具體影響機(jī)制。