
在現(xiàn)代生命科學(xué)研究和臨床診斷領(lǐng)域,博清生物科技(南京)有限公司生產(chǎn)的熒光定量PCR儀猶如一顆璀璨的明星,發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。它以其高精度、高靈敏度和快速檢測的特點,成為科研人員和臨床醫(yī)生探索生命奧秘、診斷疾病的得力助手。
一、工作原理:洞察生命分子的擴增奧秘
博清生物科技(南京)有限公司生產(chǎn)的熒光定量PCR儀的工作原理基于聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù),并結(jié)合了熒光信號檢測技術(shù)。PCR技術(shù)能夠在體外快速擴增特定的DNA片段,其過程主要包括三個基本步驟:變性、退火和延伸。
1、變性:將反應(yīng)體系加熱至94-98℃,使雙鏈DNA解離成單鏈,為后續(xù)引物結(jié)合提供模板。
2、退火:溫度降至50-65℃,特異性引物與單鏈DNA模板互補結(jié)合。引物就如同尋找目標DNA片段的 “導(dǎo)航員”,引導(dǎo) DNA 聚合酶準確找到需要擴增的區(qū)域。
3、延伸:反應(yīng)溫度升高到72℃左右,DNA聚合酶以引物為起點,沿著模板鏈合成新的DNA鏈,使得目標DNA片段數(shù)量呈指數(shù)級增長 。
博清生物科技(南京)有限公司生產(chǎn)的熒光定量PCR儀的獨特之處在于,在PCR反應(yīng)體系中加入了熒光染料或熒光標記的特異性探針。隨著PCR反應(yīng)的進行,DNA產(chǎn)物不斷增加,與之結(jié)合的熒光物質(zhì)也相應(yīng)增多,熒光信號強度隨之增強 。常見的熒光染料如SYBR Green,它能夠非特異性地嵌入雙鏈 DNA 中,只要有雙鏈DNA形成,就會發(fā)出熒光。另一種常用的是TaqMan 探針,它是一段帶有熒光報告基團和淬滅基團的寡核苷酸序列。當(dāng)探針完整時,報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收,不會產(chǎn)生熒光。但在 PCR 擴增過程中,Taq酶的5’- 3’外切酶活性會將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而釋放出熒光信號,且每擴增一條DNA鏈,就會產(chǎn)生一個熒光分子,實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。儀器通過光學(xué)系統(tǒng)實時監(jiān)測每個循環(huán)中熒光信號的變化,并根據(jù)熒光信號的增長情況繪制出擴增曲線。通過對擴增曲線的分析,利用Ct值(Cycle threshold,循環(huán)閾值,即每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))與起始模板拷貝數(shù)的對數(shù)存在的線性關(guān)系,再結(jié)合標準曲線,就能精確推算出樣本中初始DNA模板的含量。
二、系統(tǒng)組成:協(xié)同運作的精密“團隊”
1、光學(xué)系統(tǒng):這是熒光定量PCR儀的 “眼睛”,負責(zé)激發(fā)樣品中的熒光物質(zhì)并捕捉其發(fā)出的熒光信號。光源通常采用激光或高亮度LED,它們能夠發(fā)射出特定波長的光,有效激發(fā)熒光染料或探針發(fā)出熒光。熒光信號通過光纖傳輸,再經(jīng)過濾光片篩選出特定波長的熒光,最后由檢測器進行檢測。常用的檢測器有光電倍增管(PMT)和光電二極管(APD),它們能夠?qū)⑽⑷醯臒晒庑盘栟D(zhuǎn)化為電信號,并進行放大和測量。
2、熱循環(huán)系統(tǒng):如同PCR反應(yīng)的“溫控大師”,精確控制反應(yīng)過程中的溫度變化。熱循環(huán)系統(tǒng)包含多個溫控模塊,分別負責(zé)變性溫度、退火溫度和延伸溫度的精準調(diào)節(jié)。溫度控制的精度和均勻性對于PCR反應(yīng)的成敗至關(guān)重要。如果溫度不準確,可能導(dǎo)致引物無法正確結(jié)合模板,或者DNA聚合酶活性受到影響,從而使擴增結(jié)果出現(xiàn)偏差。高效的熱循環(huán)系統(tǒng)能夠快速升降溫,確保每個PCR循環(huán)在短時間內(nèi)完成,大大提高了實驗效率。例如,一些先進的熒光定量PCR儀熱循環(huán)系統(tǒng)能夠在幾秒鐘內(nèi)完成溫度的切換,且溫度均勻性誤差控制在極小范圍內(nèi)。
3、樣品板與樣品加載系統(tǒng):樣品板是PCR反應(yīng)的“舞臺”,常見的規(guī)格有96孔、384 孔等。每個孔中放置著含有待擴增DNA模板、引物、熒光染料或探針等反應(yīng)成分的反應(yīng)液。樣品板與光學(xué)系統(tǒng)緊密配合,確保儀器能夠?qū)γ總€孔中的熒光信號進行實時、準確的監(jiān)測。樣品加載系統(tǒng)則負責(zé)將樣品板準確放置到熱循環(huán)系統(tǒng)中,并實現(xiàn)樣品的自動加熱和冷卻。一些高端儀器配備了自動化的樣品加載機械臂,能夠快速、精準地將樣品板放置到位,減少人工操作帶來的誤差,同時提高了實驗的通量。
4、控制系統(tǒng)與軟件:這是熒光定量PCR儀的“大腦”,負責(zé)整個實驗過程的控制和數(shù)據(jù)處理。研究人員通過控制系統(tǒng)的用戶界面,如計算機軟件或觸摸屏,輸入實驗參數(shù),包括溫度程序、熒光信號采集時間等。軟件系統(tǒng)則根據(jù)設(shè)定的參數(shù),精確控制熱循環(huán)系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)的運行,實時采集熒光信號,并對數(shù)據(jù)進行分析處理。它能夠繪制擴增曲線、計算Ct 值、生成標準曲線,并根據(jù)標準曲線對未知樣品進行定量分析。此外,軟件還具備數(shù)據(jù)存儲、結(jié)果報告生成等功能,方便研究人員對實驗數(shù)據(jù)進行管理和分享。一些先進的軟件還支持遠程操作和監(jiān)控,研究人員可以在辦公室或其他地方通過網(wǎng)絡(luò)對儀器進行控制和查看實驗進展。
三、技術(shù)優(yōu)勢:超越傳統(tǒng)的卓越性能
1、實時檢測:與傳統(tǒng)PCR需要在反應(yīng)結(jié)束后通過電泳等方法對產(chǎn)物進行分析不同,熒光定量PCR儀能夠在PCR反應(yīng)過程中實時監(jiān)測熒光信號的變化,實時掌握擴增情況 。這不僅避免了后續(xù)繁瑣的電泳操作,大大縮短了實驗時間,還能及時發(fā)現(xiàn)實驗過程中的異常情況,如引物二聚體的形成等,便于及時調(diào)整實驗方案。
2、高靈敏度與高特異性:借助熒光探針或染料與目標DNA的特異性結(jié)合,熒光定量PCR儀能夠檢測到極低濃度的核酸樣本。即使樣本中目標核酸的含量極少,也能通過指數(shù)級擴增和熒光信號的積累被準確檢測到。同時,其高特異性能夠有效減少假陽性和假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。例如,TaqMan探針只有在與目標DNA完全互補配對時才會被酶切產(chǎn)生熒光信號,極大地提高了檢測的準確性。
3、定量分析能力:傳統(tǒng)PCR只能定性判斷目標基因是否存在,而熒光定量PCR儀能夠精確地對目標基因進行定量分析,不僅能確定基因的表達量,還能準確測量基因的拷貝數(shù) 。這種定量分析能力在研究基因表達調(diào)控、疾病診斷和藥物療效評估等方面具有不可替代的作用 。通過準確的定量分析,能夠為科研和臨床提供更有價值的數(shù)據(jù)支持。
4、自動化與高通量:現(xiàn)代熒光定量PCR儀配備了自動化樣品加載系統(tǒng)和先進的數(shù)據(jù)處理軟件,能夠?qū)崿F(xiàn)樣品的自動加載、反應(yīng)程序的自動運行和數(shù)據(jù)的自動采集與分析。一次可以同時檢測96個甚至384個樣品,大大提高了實驗的通量。這種高通量的檢測能力非常適合大規(guī)模的基因篩查、臨床樣本檢測和藥物研發(fā)中的高通量篩選等工作。
5、應(yīng)用范圍廣泛:熒光定量PCR儀在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、食品安全、農(nóng)業(yè)等多個領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用,滿足了不同領(lǐng)域科研和生產(chǎn)的需求。無論是基礎(chǔ)研究中的基因功能探索,還是臨床診斷中的疾病快速準確診斷,亦或是食品安全保障和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的品種改良與檢測,它都發(fā)揮著重要作用。
四、展望未來:持續(xù)創(chuàng)新,拓展應(yīng)用邊界
隨著科技的不斷進步,博清生物科技(南京)有限公司生產(chǎn)的熒光定量PCR儀也在持續(xù)創(chuàng)新和發(fā)展。一方面,儀器的性能將不斷提升,如進一步提高檢測的靈敏度和準確性,縮短檢測時間,降低檢測成本。在光學(xué)系統(tǒng)方面,可能會研發(fā)出更高效、更穩(wěn)定的光源和更靈敏的檢測器,以提高熒光信號的檢測精度。熱循環(huán)系統(tǒng)也將朝著更快的升降溫速度和更高的溫度均勻性方向發(fā)展。另一方面,其應(yīng)用領(lǐng)域?qū)⒉粩嗤卣埂T卺t(yī)學(xué)領(lǐng)域,可能會開發(fā)出更多針對罕見病、復(fù)雜疾病的診斷方法。在生物研究領(lǐng)域,結(jié)合單細胞測序等新興技術(shù),實現(xiàn)對單個細胞中基因表達的精準分析。在環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域,用于檢測土壤、水體和空氣中的微量污染物和微生物。同時,隨著便攜式熒光定量PCR儀的研發(fā)和推廣,將為現(xiàn)場檢測、基層醫(yī)療和應(yīng)急檢測等提供更加便捷的解決方案。熒光定量PCR儀將在生命科學(xué)的舞臺上繼續(xù)綻放光彩,為人類健康和社會發(fā)展做出更大的貢獻。
文章來源:http://www.boqinglab.com
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