在生命科學研究領(lǐng)域，細胞和微生物的培養(yǎng)是探索生命奧秘、攻克疾病難題的重要基礎(chǔ)。而培養(yǎng)環(huán)境的精確控制，直接關(guān)系到培養(yǎng)對象的生長狀態(tài)和實驗結(jié)果的準確性。博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的三氣培養(yǎng)箱憑借其能夠精準調(diào)控氧氣、二氧化碳和氮氣濃度，同時維持穩(wěn)定溫度和濕度的特性，成為科研實驗中不可或缺的關(guān)鍵設(shè)備。本實驗將通過開展腫瘤細胞低氧培養(yǎng)和厭氧微生物培養(yǎng)兩項研究，探究三氣培養(yǎng)箱在不同科研場景下的實際應用效果。

一、 實驗目的

1、利用三氣培養(yǎng)箱模擬腫瘤組織低氧微環(huán)境，研究低氧條件對腫瘤細胞增殖、遷移及相關(guān)基因表達的影響，為腫瘤的發(fā)病機制研究和靶向治療提供理論依據(jù)。

2、借助三氣培養(yǎng)箱創(chuàng)建厭氧環(huán)境，實現(xiàn)厭氧微生物的分離培養(yǎng)與特性研究，探索厭氧微生物在生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和生物技術(shù)領(lǐng)域的潛在應用價值。

二、實驗設(shè)計

（一） 實驗材料

1、細胞與微生物：

人肺癌細胞系A(chǔ)549，購自細胞庫，復蘇后在常規(guī)條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

厭氧微生物樣本，采集自湖泊底泥，保存于厭氧運輸管中。

2、試劑：

細胞培養(yǎng)：RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗、胰蛋白酶、低氧誘導因子-1α（HIF-1α）抗體、增殖細胞核抗原（PCNA）抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）抗體。

微生物培養(yǎng)：厭氧培養(yǎng)基（含酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖等成分）、刃天青指示劑（用于檢測厭氧環(huán)境）、無菌生理鹽水。

3、儀器：三氣培養(yǎng)箱（可精確調(diào)控O?、CO?、N?濃度，溫度控制范圍為4℃-60℃，濕度≥90%）、倒置顯微鏡、高速冷凍離心機、熒光定量PCR儀、蛋白免疫印跡（Western Blot）相關(guān)設(shè)備、厭氧手套箱（輔助厭氧微生物操作）。

（二） 樣本分組與處理

1、腫瘤細胞實驗：

常氧組：將A549細胞接種于含10%胎牛血清和1%雙抗的 RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于三氣培養(yǎng)箱，設(shè)置環(huán)境條件為21% O?、5% CO?、74% N?，37℃，濕度≥90%，每組設(shè)置6個生物學重復。

低氧組：同樣接種A549細胞，培養(yǎng)基成分相同，但將三氣培養(yǎng)箱環(huán)境條件調(diào)整為1% O?、5% CO?、94% N?，37℃，濕度≥90%，每組設(shè)置6個生物學重復。

2、厭氧微生物實驗：

將采集的湖泊底泥樣本用無菌生理鹽水進行梯度稀釋，分別取10?2、10?3、10??稀釋度的菌液各0.1mL，均勻涂布于厭氧培養(yǎng)基平板上。

將涂布后的平板放入三氣培養(yǎng)箱，設(shè)置環(huán)境條件為0% O?、5% CO?、95% N?，35℃，濕度≥90%，每組平板設(shè)置3個生物學重復；同時設(shè)置需氧對照平板，放置于普通二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

三、實驗操作步驟

（一） 腫瘤細胞培養(yǎng)與檢測

1、細胞接種與培養(yǎng)：

取對數(shù)生長期的A549細胞，用胰蛋白酶消化后，調(diào)整細胞濃度至5×10?個/mL，分別接種于上述兩組培養(yǎng)條件的6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入2mL細胞懸液。

培養(yǎng)24小時后，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并拍照記錄；之后每隔24小時，采用細胞計數(shù)法測定細胞數(shù)量，繪制細胞生長曲線。

2、基因表達檢測：

培養(yǎng)72小時后，收集兩組細胞，按照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

利用熒光定量PCR儀，以β- actin為內(nèi)參基因，檢測HIF-1α、PCNA、MMP-2等基因的表達水平，分析低氧條件對相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響。

3、蛋白表達檢測：

另取培養(yǎng)72小時的細胞，提取總蛋白，采用Western Blot技術(shù)檢測 HIF-1α、PCNA、MMP-2蛋白的表達量，探究低氧環(huán)境下蛋白水平的變化。

（二） 厭氧微生物培養(yǎng)與鑒定

1、培養(yǎng)過程：

將涂布好的厭氧培養(yǎng)基平板放入三氣培養(yǎng)箱后，通過觀察刃天青指示劑顏色變化確認厭氧環(huán)境建立情況（無氧時指示劑由藍色變?yōu)闊o色）。

培養(yǎng)5-7天后，觀察厭氧微生物在平板上的菌落形態(tài)、顏色、大小等特征，并與需氧對照平板進行對比。

2、微生物分離與鑒定：

挑選厭氧平板上不同形態(tài)的單菌落，采用劃線分離法進行純化，重復3-4次直至獲得純培養(yǎng)物。

對純化后的厭氧微生物進行16S rRNA基因擴增與測序，將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對，鑒定微生物種類。

四、實驗結(jié)果分析

（一） 腫瘤細胞實驗結(jié)果

1、細胞形態(tài)與增殖：

常氧組細胞呈梭形，貼壁生長良好，細胞間連接緊密；低氧組細胞形態(tài)發(fā)生改變，部分細胞變圓，貼壁能力減弱。

細胞生長曲線顯示，低氧組細胞增殖速率明顯低于常氧組，差異具有統(tǒng)計學意義（P< 0.05）。

2、基因與蛋白表達：

熒光定量 PCR 結(jié)果表明，低氧組HIF-1α、MMP-2基因表達水平顯著高于常氧組（P< 0.01），而 PCNA 基因表達量降低（P<0.05）。

Western Blot 檢測結(jié)果與基因表達趨勢一致，低氧組HIF-1α、MMP-2蛋白表達上調(diào)，PCNA蛋白表達下調(diào)。

（二）厭氧微生物實驗結(jié)果

1、培養(yǎng)與分離：

三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的厭氧平板上，成功生長出多種形態(tài)的菌落，而需氧對照平板上幾乎無菌落生長，表明三氣培養(yǎng)箱創(chuàng)建的厭氧環(huán)境滿足微生物生長需求。

經(jīng)劃線分離，共獲得5株純培養(yǎng)的厭氧微生物。

2、鑒定結(jié)果：

16S rRNA基因測序比對顯示，5株厭氧微生物分別屬于擬桿菌屬（Bacteroides）、梭菌屬（Clostridium）等不同的分類單元，為后續(xù)深入研究其功能特性奠定基礎(chǔ)。

五、實驗結(jié)論

本實驗通過腫瘤細胞低氧培養(yǎng)和厭氧微生物培養(yǎng)兩項研究，充分驗證了博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的三氣培養(yǎng)箱在科研實驗中的重要作用和應用價值。在腫瘤細胞研究方面，博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的三氣培養(yǎng)箱能夠精準模擬低氧微環(huán)境，顯著影響腫瘤細胞的生長、遷移及相關(guān)基因和蛋白的表達，為腫瘤生物學研究提供了可靠的實驗條件。在厭氧微生物培養(yǎng)中，博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的三氣培養(yǎng)箱可有效創(chuàng)建穩(wěn)定的厭氧環(huán)境，實現(xiàn)厭氧微生物的分離培養(yǎng)與鑒定，有助于挖掘厭氧微生物資源的潛在應用。實驗結(jié)果表明，博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的三氣培養(yǎng)箱憑借其精確的氣體濃度調(diào)控、穩(wěn)定的溫度和濕度控制，能夠滿足多種科研實驗需求，是開展生命科學研究的重要技術(shù)支撐。未來可進一步拓展三氣培養(yǎng)箱在其他特殊培養(yǎng)條件下的應用，探索其在更廣泛科研領(lǐng)域的潛在價值。