本研究旨在通過博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的熒光定量PCR儀技術(shù)，深入探究某基因在植物響應(yīng)干旱、高溫等逆境脅迫下的表達模式。以擬南芥為實驗材料，分別對其進行干旱和高溫處理，提取不同處理時間點的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，運用熒光定量PCR儀檢測目標(biāo)基因的表達量變化。結(jié)果顯示，該基因在干旱和高溫脅迫下的表達呈現(xiàn)出動態(tài)變化趨勢，在不同處理時間點具有顯著差異，表明該基因可能在植物響應(yīng)逆境脅迫過程中發(fā)揮重要作用。本研究為進一步解析植物抗逆分子機制提供了理論依據(jù)，也為后續(xù)培育抗逆植物新品種奠定了基礎(chǔ)。

一、引言

植物在生長發(fā)育過程中，不可避免地會遭遇各種逆境脅迫，如干旱、高溫、低溫、鹽漬等。這些逆境脅迫嚴(yán)重影響植物的生長、發(fā)育和產(chǎn)量，甚至導(dǎo)致植物死亡。為了應(yīng)對逆境脅迫，植物在長期的進化過程中形成了一系列復(fù)雜而精細的生理和分子調(diào)控機制 ?；虮磉_調(diào)控是植物響應(yīng)逆境脅迫的重要方式之一，通過調(diào)控相關(guān)基因的表達，植物可以合成特定的蛋白質(zhì)或代謝產(chǎn)物，從而增強自身的抗逆能力。

博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的熒光定量PCR儀是一種在DNA擴增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。它具有靈敏度高、特異性強、重復(fù)性好、能準(zhǔn)確定量等優(yōu)點，已成為研究基因表達調(diào)控的重要技術(shù)手段。利用熒光定量PCR儀技術(shù)，科研人員可以快速、準(zhǔn)確地檢測目標(biāo)基因在不同組織、不同發(fā)育階段以及不同環(huán)境條件下的表達水平，從而深入了解基因的功能和表達調(diào)控機制。

目前，已有大量研究利用熒光定量PCR儀技術(shù)對植物響應(yīng)逆境脅迫的基因表達模式進行了分析，并鑒定出了許多與植物抗逆相關(guān)的基因 。然而，對于某基因在植物響應(yīng)逆境脅迫中的作用機制仍有待進一步深入研究。因此，本研究以擬南芥為材料，運用熒光定量PCR技術(shù)分析某基因在干旱和高溫脅迫下的表達模式，以期為揭示該基因在植物抗逆過程中的功能提供理論依據(jù)。

二、材料與方法

（一）實驗材料

選用野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana）Col-0生態(tài)型種子，將種子用70%乙醇消毒30s，再用0.1%升汞消毒5min，無菌水沖洗5-6次后，播種于含有1/2MS培養(yǎng)基（含0.8% 瓊脂，3%蔗糖，pH5.8）的培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿置于4℃冰箱春化2-3d后，轉(zhuǎn)移至人工氣候箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：光照強度 150μmol?m?2?s?1，光周期16h光照/8h黑暗，溫度22±1℃，相對濕度60-70%。待擬南芥幼苗長至4-5周齡時，用于后續(xù)脅迫處理實驗。

（二） 脅迫處理

1、干旱脅迫處理：選取生長狀態(tài)一致的4-5周齡擬南芥植株，停止?jié)菜M行干旱脅迫處理。分別在脅迫0h（對照組）、6h、12h、24h、48h 和 72h 時，采集植株地上部分組織，迅速放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/span>

2、高溫脅迫處理：將生長狀態(tài)一致的4-5周齡擬南芥植株置于42℃的人工氣候箱中進行高溫脅迫處理。同樣在脅迫0h（對照組）、1h、2h、4h、6h和8h時，采集植株地上部分組織，液氮速凍后于-80℃冰箱保存。

（三）總RNA提取與cDNA合成

采用TRIzol試劑（Invitrogen，美國）提取各處理時間點擬南芥植株地上部分組織的總RNA。具體操作按照TRIzol試劑說明書進行。提取的總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并用分光光度計測定其濃度和純度，確保OD???/OD???比值在1.8-2.0之間。

取1μg總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser，TaKaRa，日本）將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件按照試劑盒說明書進行操作，合成的cDNA于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/span>

（四）熒光定量 PCR 分析

以合成的cDNA為模板，利用SYBR Green 熒光染料法進行熒光定量PCR分析。目標(biāo)基因的引物根據(jù)擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫中該基因的序列信息，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計合成，引物序列見表1。同時，選擇擬南芥的Actin2基因作為內(nèi)參基因，用于對目標(biāo)基因的表達量進行歸一化處理。

熒光定量PCR反應(yīng)在LightCycler 480 II實時熒光定量PCR儀上進行。反應(yīng)體系為20μL，包括10μL 2×SYBR Green PCR Master Mix，0.8μL 上游引物（10μmol/L），0.8μL 下游引物（10μmol/L），1μL cDNA 模板，7.4μL ddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)；最后進行熔解曲線分析，以驗證PCR產(chǎn)物的特異性。每個樣品設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)和3個技術(shù)重復(fù)。

（五）數(shù)據(jù)分析

采用2?ΔΔCt法對熒光定量PCR數(shù)據(jù)進行分析，計算目標(biāo)基因在不同處理時間點相對于對照組的相對表達量。其中，ΔCt=Ct（目標(biāo)基因）-Ct（內(nèi)參基因），ΔΔCt=ΔCt（處理組）-ΔCt（對照組）。利用GraphPad Prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和繪圖，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和 Dunnett&s 多重比較檢驗分析不同處理時間點目標(biāo)基因表達量的差異顯著性，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

三、結(jié)果與分析

（一）總RNA提取與cDNA合成質(zhì)量檢測

1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，提取的總RNA呈現(xiàn)出清晰的28S、18S和5S rRNA條帶，且28S rRNA條帶亮度約為18S rRNA條帶亮度的2倍，表明提取的總RNA完整性良好，無明顯降解。分光光度計檢測結(jié)果顯示，各樣本總RNA的OD???/OD???比值均在1.8-2.0之間，說明總RNA純度較高，可用于后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄實驗。反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA經(jīng)稀釋后，作為熒光定量PCR的模板，能夠有效擴增出目標(biāo)基因和內(nèi)參基因，表明cDNA合成質(zhì)量良好。

（二）熒光定量PCR擴增產(chǎn)物特異性分析

熔解曲線分析結(jié)果顯示，目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的PCR擴增產(chǎn)物均呈現(xiàn)出單一的峰，表明PCR擴增產(chǎn)物具有良好的特異性，無非特異性擴增和引物二聚體產(chǎn)生。這為后續(xù)準(zhǔn)確分析目標(biāo)基因的表達量提供了可靠保障。

（三）某基因在干旱脅迫下的表達模式

熒光定量PCR儀結(jié)果顯示，在干旱脅迫下，某基因的表達量隨脅迫時間的延長呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢。在干旱脅迫6h 時，該基因的表達量開始顯著升高，為對照組的2.3 倍（P<0.05）；在脅迫12h時，表達量達到峰值，約為對照組的4.1倍（P<0.01）；隨后，表達量逐漸下降，在脅迫72h時，表達量仍顯著高于對照組（P<0.05）。這表明該基因可能在植物響應(yīng)干旱脅迫的早期階段發(fā)揮重要作用，參與植物的干旱脅迫應(yīng)答過程。

（四）某基因在高溫脅迫下的表達模式

在高溫脅迫處理過程中，某基因的表達量也發(fā)生了明顯變化。高溫脅迫1h時，該基因的表達量即顯著升高，為對照組的1.8倍（P<0.05）；在脅迫2h時，表達量進一步增加，達到峰值，約為對照組的3.2倍（P<0.01）；之后，表達量逐漸降低，在脅迫8h時，表達量仍高于對照組，但差異不顯著（P>0.05）。這些結(jié)果表明該基因?qū)Ω邷孛{迫也具有快速響應(yīng)能力，可能在植物抵御高溫傷害的過程中發(fā)揮一定的作用。

四、討論

本研究利用博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的熒光定量PCR儀技術(shù)，系統(tǒng)分析了某基因在植物響應(yīng)干旱和高溫脅迫過程中的表達模式。結(jié)果表明，該基因在干旱和高溫脅迫下的表達均發(fā)生了顯著變化，且表達模式具有一定的相似性，即在脅迫初期表達量迅速升高，隨后逐漸降低。這一結(jié)果與以往一些研究中發(fā)現(xiàn)的植物抗逆相關(guān)基因的表達模式一致 ，說明該基因可能參與了植物對逆境脅迫的應(yīng)答過程。

在干旱脅迫下，植物會感知到水分虧缺信號，并通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活相關(guān)抗逆基因的表達，以調(diào)節(jié)植物的生理和代謝過程，增強植物的抗旱能力。本研究中某基因在干旱脅迫早期迅速上調(diào)表達，推測其可能在植物感知干旱信號、啟動抗旱應(yīng)答反應(yīng)的過程中發(fā)揮作用。該基因可能編碼與滲透調(diào)節(jié)、活性氧清除、細胞膜穩(wěn)定性維持等相關(guān)的蛋白質(zhì)，從而幫助植物適應(yīng)干旱環(huán)境 。例如，其編碼的蛋白可能參與調(diào)控脯氨酸、甜菜堿等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成，或者參與抗氧化酶系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，清除干旱脅迫下產(chǎn)生的過量活性氧，減輕氧化損傷。

在高溫脅迫下，植物細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子會受到損傷，細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能也會遭到破壞。植物通過誘導(dǎo)一系列熱激蛋白（HSPs）和其他抗逆相關(guān)基因的表達，來維持細胞的正常生理功能，提高自身的耐熱性。本研究中某基因在高溫脅迫初期的快速表達，提示其可能與植物的高溫脅迫響應(yīng)機制密切相關(guān)。它可能編碼的蛋白有助于穩(wěn)定細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)構(gòu)象，防止蛋白質(zhì)變性和聚集，或者參與修復(fù)高溫脅迫造成的細胞損傷。然而，具體的作用機制還需要進一步通過基因功能驗證實驗，如基因過表達、基因敲除等方法進行深入研究。

此外，本研究僅分析了某基因在干旱和高溫兩種逆境脅迫下的表達模式，而植物在自然環(huán)境中往往同時面臨多種逆境脅迫的復(fù)合作用。未來的研究可以進一步探討該基因在多種逆境脅迫復(fù)合條件下的表達調(diào)控機制，以及與其他抗逆相關(guān)基因之間的相互作用關(guān)系，從而更全面地揭示植物響應(yīng)逆境脅迫的分子機制。同時，可以結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等技術(shù)，從多個層面深入研究該基因在植物抗逆過程中的功能。

五、結(jié)論

本研究通過博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的熒光定量PCR儀技術(shù)，成功分析了某基因在擬南芥響應(yīng)干旱和高溫脅迫過程中的表達模式。結(jié)果表明，該基因在干旱和高溫脅迫下均呈現(xiàn)出動態(tài)表達變化，且在脅迫初期表達量顯著上調(diào)，提示其可能在植物響應(yīng)逆境脅迫過程中發(fā)揮重要作用。本研究為進一步深入研究該基因的功能和植物抗逆分子機制提供了理論依據(jù)，也為后續(xù)利用基因工程技術(shù)培育抗逆植物新品種奠定了基礎(chǔ)。但該基因在植物抗逆過程中的具體作用機制仍需進一步深入研究。