本研究旨在通過博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的熒光定量PCR儀技術(shù)，深入探究某基因在植物響應(yīng)干旱、高溫等逆境脅迫下的表達(dá)模式。以擬南芥為實(shí)驗(yàn)材料，分別對(duì)其進(jìn)行干旱和高溫處理，提取不同處理時(shí)間點(diǎn)的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，運(yùn)用熒光定量PCR儀檢測(cè)目標(biāo)基因的表達(dá)量變化。結(jié)果顯示，該基因在干旱和高溫脅迫下的表達(dá)呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，在不同處理時(shí)間點(diǎn)具有顯著差異，表明該基因可能在植物響應(yīng)逆境脅迫過程中發(fā)揮重要作用。本研究為進(jìn)一步解析植物抗逆分子機(jī)制提供了理論依據(jù)，也為后續(xù)培育抗逆植物新品種奠定了基礎(chǔ)。

一、引言

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中，不可避免地會(huì)遭遇各種逆境脅迫，如干旱、高溫、低溫、鹽漬等。這些逆境脅迫嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)、發(fā)育和產(chǎn)量，甚至導(dǎo)致植物死亡。為了應(yīng)對(duì)逆境脅迫，植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成了一系列復(fù)雜而精細(xì)的生理和分子調(diào)控機(jī)制 ?；虮磉_(dá)調(diào)控是植物響應(yīng)逆境脅迫的重要方式之一，通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，植物可以合成特定的蛋白質(zhì)或代謝產(chǎn)物，從而增強(qiáng)自身的抗逆能力。

博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的熒光定量PCR儀是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。它具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、能準(zhǔn)確定量等優(yōu)點(diǎn)，已成為研究基因表達(dá)調(diào)控的重要技術(shù)手段。利用熒光定量PCR儀技術(shù)，科研人員可以快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)目標(biāo)基因在不同組織、不同發(fā)育階段以及不同環(huán)境條件下的表達(dá)水平，從而深入了解基因的功能和表達(dá)調(diào)控機(jī)制。

目前，已有大量研究利用熒光定量PCR儀技術(shù)對(duì)植物響應(yīng)逆境脅迫的基因表達(dá)模式進(jìn)行了分析，并鑒定出了許多與植物抗逆相關(guān)的基因 。然而，對(duì)于某基因在植物響應(yīng)逆境脅迫中的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。因此，本研究以擬南芥為材料，運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)分析某基因在干旱和高溫脅迫下的表達(dá)模式，以期為揭示該基因在植物抗逆過程中的功能提供理論依據(jù)。

二、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

選用野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana）Col-0生態(tài)型種子，將種子用70%乙醇消毒30s，再用0.1%升汞消毒5min，無菌水沖洗5-6次后，播種于含有1/2MS培養(yǎng)基（含0.8% 瓊脂，3%蔗糖，pH5.8）的培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿置于4℃冰箱春化2-3d后，轉(zhuǎn)移至人工氣候箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度 150μmol?m?2?s?1，光周期16h光照/8h黑暗，溫度22±1℃，相對(duì)濕度60-70%。待擬南芥幼苗長(zhǎng)至4-5周齡時(shí)，用于后續(xù)脅迫處理實(shí)驗(yàn)。

（二） 脅迫處理

1、干旱脅迫處理：選取生長(zhǎng)狀態(tài)一致的4-5周齡擬南芥植株，停止?jié)菜?，進(jìn)行干旱脅迫處理。分別在脅迫0h（對(duì)照組）、6h、12h、24h、48h 和 72h 時(shí)，采集植株地上部分組織，迅速放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/span>

2、高溫脅迫處理：將生長(zhǎng)狀態(tài)一致的4-5周齡擬南芥植株置于42℃的人工氣候箱中進(jìn)行高溫脅迫處理。同樣在脅迫0h（對(duì)照組）、1h、2h、4h、6h和8h時(shí)，采集植株地上部分組織，液氮速凍后于-80℃冰箱保存。

（三）總RNA提取與cDNA合成

采用TRIzol試劑（Invitrogen，美國(guó)）提取各處理時(shí)間點(diǎn)擬南芥植株地上部分組織的總RNA。具體操作按照TRIzol試劑說明書進(jìn)行。提取的總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，并用分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度，確保OD???/OD???比值在1.8-2.0之間。

取1μg總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser，TaKaRa，日本）將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，合成的cDNA于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/span>

（四）熒光定量 PCR 分析

以合成的cDNA為模板，利用SYBR Green 熒光染料法進(jìn)行熒光定量PCR分析。目標(biāo)基因的引物根據(jù)擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫中該基因的序列信息，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)合成，引物序列見表1。同時(shí)，選擇擬南芥的Actin2基因作為內(nèi)參基因，用于對(duì)目標(biāo)基因的表達(dá)量進(jìn)行歸一化處理。

熒光定量PCR反應(yīng)在LightCycler 480 II實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系為20μL，包括10μL 2×SYBR Green PCR Master Mix，0.8μL 上游引物（10μmol/L），0.8μL 下游引物（10μmol/L），1μL cDNA 模板，7.4μL ddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)；最后進(jìn)行熔解曲線分析，以驗(yàn)證PCR產(chǎn)物的特異性。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

（五）數(shù)據(jù)分析

采用2?ΔΔCt法對(duì)熒光定量PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算目標(biāo)基因在不同處理時(shí)間點(diǎn)相對(duì)于對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量。其中，ΔCt=Ct（目標(biāo)基因）-Ct（內(nèi)參基因），ΔΔCt=ΔCt（處理組）-ΔCt（對(duì)照組）。利用GraphPad Prism 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和 Dunnett&s 多重比較檢驗(yàn)分析不同處理時(shí)間點(diǎn)目標(biāo)基因表達(dá)量的差異顯著性，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

三、結(jié)果與分析

（一）總RNA提取與cDNA合成質(zhì)量檢測(cè)

1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，提取的總RNA呈現(xiàn)出清晰的28S、18S和5S rRNA條帶，且28S rRNA條帶亮度約為18S rRNA條帶亮度的2倍，表明提取的總RNA完整性良好，無明顯降解。分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果顯示，各樣本總RNA的OD???/OD???比值均在1.8-2.0之間，說明總RNA純度較高，可用于后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA經(jīng)稀釋后，作為熒光定量PCR的模板，能夠有效擴(kuò)增出目標(biāo)基因和內(nèi)參基因，表明cDNA合成質(zhì)量良好。

（二）熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物特異性分析

熔解曲線分析結(jié)果顯示，目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均呈現(xiàn)出單一的峰，表明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具有良好的特異性，無非特異性擴(kuò)增和引物二聚體產(chǎn)生。這為后續(xù)準(zhǔn)確分析目標(biāo)基因的表達(dá)量提供了可靠保障。

（三）某基因在干旱脅迫下的表達(dá)模式

熒光定量PCR儀結(jié)果顯示，在干旱脅迫下，某基因的表達(dá)量隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢(shì)。在干旱脅迫6h 時(shí)，該基因的表達(dá)量開始顯著升高，為對(duì)照組的2.3 倍（P<0.05）；在脅迫12h時(shí)，表達(dá)量達(dá)到峰值，約為對(duì)照組的4.1倍（P<0.01）；隨后，表達(dá)量逐漸下降，在脅迫72h時(shí)，表達(dá)量仍顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。這表明該基因可能在植物響應(yīng)干旱脅迫的早期階段發(fā)揮重要作用，參與植物的干旱脅迫應(yīng)答過程。

（四）某基因在高溫脅迫下的表達(dá)模式

在高溫脅迫處理過程中，某基因的表達(dá)量也發(fā)生了明顯變化。高溫脅迫1h時(shí)，該基因的表達(dá)量即顯著升高，為對(duì)照組的1.8倍（P<0.05）；在脅迫2h時(shí)，表達(dá)量進(jìn)一步增加，達(dá)到峰值，約為對(duì)照組的3.2倍（P<0.01）；之后，表達(dá)量逐漸降低，在脅迫8h時(shí)，表達(dá)量仍高于對(duì)照組，但差異不顯著（P>0.05）。這些結(jié)果表明該基因?qū)Ω邷孛{迫也具有快速響應(yīng)能力，可能在植物抵御高溫傷害的過程中發(fā)揮一定的作用。

四、討論

本研究利用博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的熒光定量PCR儀技術(shù)，系統(tǒng)分析了某基因在植物響應(yīng)干旱和高溫脅迫過程中的表達(dá)模式。結(jié)果表明，該基因在干旱和高溫脅迫下的表達(dá)均發(fā)生了顯著變化，且表達(dá)模式具有一定的相似性，即在脅迫初期表達(dá)量迅速升高，隨后逐漸降低。這一結(jié)果與以往一些研究中發(fā)現(xiàn)的植物抗逆相關(guān)基因的表達(dá)模式一致 ，說明該基因可能參與了植物對(duì)逆境脅迫的應(yīng)答過程。

在干旱脅迫下，植物會(huì)感知到水分虧缺信號(hào)，并通過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活相關(guān)抗逆基因的表達(dá)，以調(diào)節(jié)植物的生理和代謝過程，增強(qiáng)植物的抗旱能力。本研究中某基因在干旱脅迫早期迅速上調(diào)表達(dá)，推測(cè)其可能在植物感知干旱信號(hào)、啟動(dòng)抗旱應(yīng)答反應(yīng)的過程中發(fā)揮作用。該基因可能編碼與滲透調(diào)節(jié)、活性氧清除、細(xì)胞膜穩(wěn)定性維持等相關(guān)的蛋白質(zhì)，從而幫助植物適應(yīng)干旱環(huán)境 。例如，其編碼的蛋白可能參與調(diào)控脯氨酸、甜菜堿等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成，或者參與抗氧化酶系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，清除干旱脅迫下產(chǎn)生的過量活性氧，減輕氧化損傷。

在高溫脅迫下，植物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子會(huì)受到損傷，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能也會(huì)遭到破壞。植物通過誘導(dǎo)一系列熱激蛋白（HSPs）和其他抗逆相關(guān)基因的表達(dá)，來維持細(xì)胞的正常生理功能，提高自身的耐熱性。本研究中某基因在高溫脅迫初期的快速表達(dá)，提示其可能與植物的高溫脅迫響應(yīng)機(jī)制密切相關(guān)。它可能編碼的蛋白有助于穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)構(gòu)象，防止蛋白質(zhì)變性和聚集，或者參與修復(fù)高溫脅迫造成的細(xì)胞損傷。然而，具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步通過基因功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，如基因過表達(dá)、基因敲除等方法進(jìn)行深入研究。

此外，本研究?jī)H分析了某基因在干旱和高溫兩種逆境脅迫下的表達(dá)模式，而植物在自然環(huán)境中往往同時(shí)面臨多種逆境脅迫的復(fù)合作用。未來的研究可以進(jìn)一步探討該基因在多種逆境脅迫復(fù)合條件下的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，以及與其他抗逆相關(guān)基因之間的相互作用關(guān)系，從而更全面地揭示植物響應(yīng)逆境脅迫的分子機(jī)制。同時(shí)，可以結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等技術(shù)，從多個(gè)層面深入研究該基因在植物抗逆過程中的功能。

五、結(jié)論

本研究通過博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的熒光定量PCR儀技術(shù)，成功分析了某基因在擬南芥響應(yīng)干旱和高溫脅迫過程中的表達(dá)模式。結(jié)果表明，該基因在干旱和高溫脅迫下均呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài)表達(dá)變化，且在脅迫初期表達(dá)量顯著上調(diào)，提示其可能在植物響應(yīng)逆境脅迫過程中發(fā)揮重要作用。本研究為進(jìn)一步深入研究該基因的功能和植物抗逆分子機(jī)制提供了理論依據(jù)，也為后續(xù)利用基因工程技術(shù)培育抗逆植物新品種奠定了基礎(chǔ)。但該基因在植物抗逆過程中的具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。