一、實驗目的

本實驗旨在運用博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的熒光定量PCR儀，探究在不同藥物濃度處理下，細胞中特定基因的表達水平變化，從而分析藥物對該基因表達的調(diào)控作用，為進一步研究藥物作用機制及潛在的臨床應用提供實驗依據(jù)。

二、實驗設(shè)計

（一） 實驗材料

1、細胞系：選取人源肺癌細胞系A(chǔ)549，該細胞系在體外培養(yǎng)條件下生長狀態(tài)良好，可用于研究腫瘤相關(guān)基因表達。

2、藥物：選擇新型抗腫瘤藥物X，將其配置成0μM（對照組）、1μM、5μM、10μM四種不同濃度梯度的溶液，以探究藥物濃度與基因表達的關(guān)系。

3、試劑：RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green 熒光定量PCR預混試劑、無RNA酶水、引物（針對目標基因及內(nèi)參基因GAPDH設(shè)計合成）。

4、儀器：熒光定量PCR儀、高速冷凍離心機、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、渦旋振蕩器、微量分光光度計。

（二）樣本分組與處理

將培養(yǎng)的A549細胞均勻分為4組，每組設(shè)置3個生物學重復。分別用不同濃度的藥物X處理細胞，對照組僅加入等量的溶劑（0.1%DMSO），在37℃、5% CO?的恒溫培養(yǎng)箱中孵育24小時后，收集細胞用于后續(xù)實驗。

三、實驗操作步驟

（一） RNA提取

1、在超凈工作臺中，棄去細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用預冷的 PBS 緩沖液輕輕洗滌細胞2次，以去除殘留的培養(yǎng)基成分。

2、每孔加入1ml TRIzol試劑，用槍頭反復吹打細胞，使細胞充分裂解，室溫靜置5分鐘，以確保RNA充分釋放。

3、將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5ml無RNA酶的離心管中，加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置2 - 3分鐘，使有機相和水相充分分層。

4、4℃、12000rpm離心15分鐘，此時離心管中會出現(xiàn)三層，上層無色水相含有RNA，中間層為白色蛋白層，下層為紅色有機相。小心吸取上層水相至新的離心管中，避免吸到中間層和下層液體，以防RNA污染。

5、加入等體積的異丙醇，顛倒混勻后，室溫靜置10分鐘，使RNA沉淀。

6、4℃、12000rpm離心10分鐘，棄去上清液，此時可見管底有白色沉淀，即為RNA。

7、加入1ml 75%乙醇洗滌RNA沉淀，4℃、7500rpm離心5分鐘，棄去上清液，盡量吸干殘留乙醇，防止乙醇影響后續(xù)實驗。

8、室溫晾干RNA沉淀5-10分鐘，待乙醇完全揮發(fā)后，加入適量無RNA酶水溶解RNA，用微量分光光度計測定RNA濃度和純度，確保OD???/OD???比值在1.8-2.0之間，說明RNA純度較高，可用于后續(xù)實驗。

（二） 反轉(zhuǎn)錄

1、按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，在無RNA酶的離心管中配制反轉(zhuǎn)錄反應體系RNA模板2μg、隨機引物1μl、dNTP Mix 1μl、5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液4μl、反轉(zhuǎn)錄酶1μl，用無RNA酶水補足至20μl。

2、輕輕混勻反應體系后，短暫離心使液體集中于管底。

3、將離心管置于PCR儀中，按照以下程序進行反轉(zhuǎn)錄反應：16℃ 15分鐘，42℃ 30分鐘，85℃ 5分鐘，反應結(jié)束后，將cDNA產(chǎn)物置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/span>

（三） 熒光定量PCR

1、準備反應體系：在96孔PCR反應板中，依次加入SYBR Green熒光定量PCR預混試劑10μl、上下游引物（10μM）各0.5μl、cDNA模板2μl，用無RNA酶水補足至20μl。為避免實驗誤差，每孔設(shè)置3個技術(shù)重復。

2、用封板膜將反應板密封，輕輕振蕩混勻后，短暫離心使液體集中于孔底。

3、將反應板放入熒光定量PCR儀中，設(shè)置反應程序：95℃預變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，40個循環(huán)；反應結(jié)束后，進行熔解曲線分析，從60℃升溫至95℃，升溫速率為0.5℃/s，以檢測PCR產(chǎn)物的特異性。

四、實驗結(jié)果分析

（一）原始數(shù)據(jù)獲取

熒光定量PCR儀運行結(jié)束后，導出每個樣本的Ct值（循環(huán)閾值），Ct值表示PCR反應過程中熒光信號達到設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，Ct 值與初始模板量的對數(shù)呈線性關(guān)系，Ct值越小，說明初始模板量越多。

（二）數(shù)據(jù)分析方法

采用2^-ΔΔCt 法進行相對定量分析。首先，計算每個樣本目標基因與內(nèi)參基因GAPDH的ΔCt 值（ΔCt= Ct目標基因-CtGAPDH）；然后，以對照組的ΔCt平均值作為校準值，計算其他處理組的ΔΔCt值（ΔΔCt=ΔCt處理組-ΔCt對照組平均值）；最后，通過公式2^-ΔΔCt 計算各處理組目標基因相對于對照組的表達倍數(shù)變化。

（三）結(jié)果呈現(xiàn)

繪制柱狀圖展示不同藥物濃度處理組與對照組相比，目標基因表達水平的變化情況。同時，運用統(tǒng)計學軟件（如GraphPad Prism）進行單因素方差分析（One-way ANOVA），并進行Tukey多重比較，判斷不同處理組之間的差異是否具有統(tǒng)計學意義（P<0.05表示差異顯著）。

五、實驗結(jié)論

通過本實驗，成功運用博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的熒光定量PCR儀檢測了不同藥物濃度處理下細胞中特定基因的表達水平變化。實驗結(jié)果表明，隨著藥物X濃度的增加，目標基因的表達水平呈現(xiàn)出[上升/下降/先上升后下降等具體趨勢]，且在[具體濃度]時，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義。這一結(jié)果初步揭示了藥物X對該基因表達具有[促進/抑制/雙向調(diào)控等]作用，為后續(xù)深入研究藥物作用機制提供了重要的實驗數(shù)據(jù)支持。同時，本實驗的操作流程和數(shù)據(jù)分析方法也為其他類似的熒光定量PCR實驗提供了參考范例。