在生命科學與醫(yī)學領(lǐng)域，對核酸分子進行精準定量分析是眾多研究和臨床診斷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的熒光定量PCR儀憑借其獨特的技術(shù)原理，成為實現(xiàn)這一目標的核心工具。下面，將從基礎(chǔ)技術(shù)到實現(xiàn)方式，全方位解析熒光定量PCR儀的工作原理。

一、聚合酶鏈式反應（PCR）：定量分析的基石

聚合酶鏈式反應（PCR）是熒光定量PCR儀運行的基礎(chǔ)，它能在體外模擬細胞內(nèi)DNA復制過程，實現(xiàn)特定DNA片段的快速擴增。PCR反應以溫度變化為驅(qū)動，通過不斷循環(huán)“變性-退火-延伸”三個步驟，使目的DNA片段呈指數(shù)級增長。

在變性階段，反應體系被加熱至約95℃，高溫破壞DNA雙鏈間的氫鍵，使雙鏈DNA解旋成為兩條單鏈，為后續(xù)引物結(jié)合和新鏈合成提供模板。退火過程中，溫度降至55-65℃，根據(jù)目的基因設計的特異性引物，憑借堿基互補配對原則，與單鏈DNA模板的特定區(qū)域結(jié)合。最后，當溫度上升到72℃左右，DNA聚合酶發(fā)揮作用，以四種脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）為原料，從引物的3’端開始，沿著模板DNA鏈合成新的互補DNA鏈，完成一次PCR循環(huán)。隨著循環(huán)次數(shù)增加，目的DNA片段數(shù)量以2?（n為循環(huán)次數(shù)）的速度增長，原本極微量的目標DNA可被擴增至上百萬倍，從而便于后續(xù)檢測分析。

二、熒光定量技術(shù)：實現(xiàn)實時監(jiān)測的關(guān)鍵

博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的熒光定量PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，引入熒光檢測系統(tǒng)，通過檢測PCR過程中熒光信號的變化，實現(xiàn)對PCR產(chǎn)物的實時定量分析。目前，常用的熒光定量方法主要有熒光染料法和熒光探針法，二者從不同機制實現(xiàn)對PCR產(chǎn)物的精準監(jiān)測。

（一）熒光染料法

SYBR Green是熒光染料法中最具代表性的熒光染料，它能夠非特異性地與雙鏈DNA的小溝區(qū)域結(jié)合。在PCR反應開始前，SYBR Green處于游離狀態(tài)，幾乎不發(fā)出熒光。隨著PCR擴增進行，雙鏈DNA產(chǎn)物不斷生成，SYBR Green染料分子嵌入雙鏈DNA小溝，形成染料-DNA復合物，該復合物在激發(fā)光作用下可發(fā)出熒光，且熒光強度與雙鏈DNA的數(shù)量成正比。通過實時監(jiān)測熒光信號強度，就能直觀反映PCR反應進程中產(chǎn)物的積累情況。當反應結(jié)束后，根據(jù)標準曲線，即可推算出樣品中初始模板DNA的含量。這種方法操作簡便、成本較低，適用于對多種DNA模板的快速定量檢測，但由于其對所有雙鏈DNA均有結(jié)合作用，容易受到引物二聚體等非特異性擴增產(chǎn)物的干擾。

（二）熒光探針法

以TaqMan探針為代表的熒光探針法，實現(xiàn)了對目標DNA片段的特異性檢測。TaqMan探針是一段長度為18-24個堿基的寡核苷酸序列，其5’端標記有熒光報告基團（如FAM），3’端標記有熒光淬滅基團（如TAMRA）。在PCR反應體系中，當探針保持完整時，由于報告基團和淬滅基團距離較近，報告基團發(fā)射的熒光信號會被淬滅基團吸收，檢測系統(tǒng)無法檢測到熒光。在PCR擴增過程中，當引物與模板結(jié)合并開始延伸時，Taq DNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性發(fā)揮作用，將與模板互補結(jié)合的TaqMan探針逐步酶切降解，使報告基團與淬滅基團分離。此時，報告基團不再受淬滅基團的影響，在激發(fā)光照射下能夠發(fā)射出可被檢測系統(tǒng)捕捉的熒光信號。隨著PCR產(chǎn)物不斷增加，被切割的探針數(shù)量增多，熒光信號強度也隨之增強，通過檢測熒光信號的變化，就能實現(xiàn)對目標DNA的定量分析。這種方法特異性強，可有效避免非特異性擴增的干擾，尤其適用于復雜樣本中低豐度目標基因的檢測，但探針設計和合成成本相對較高。

三、熒光定量PCR儀的硬件支撐

博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的熒光定量PCR儀的精準工作離不開其精密的硬件系統(tǒng)，主要包括熱循環(huán)系統(tǒng)和熒光檢測系統(tǒng)。熱循環(huán)系統(tǒng)負責實現(xiàn)PCR反應所需的溫度循環(huán)，多采用半導體加熱制冷技術(shù)，可快速、精準地控制反應溫度，確保每個循環(huán)中變性、退火、延伸步驟的溫度條件穩(wěn)定，為PCR反應提供可靠的環(huán)境。熒光檢測系統(tǒng)則是實現(xiàn)熒光定量的核心，由熒光激發(fā)部件、光信號傳輸部件、熒光檢測部件和控制系統(tǒng)組成。熒光激發(fā)部件通常采用穩(wěn)定的LED光源，為熒光物質(zhì)提供激發(fā)光；光信號傳輸部件利用耐高溫的導光光纖，高效傳輸熒光信號；熒光檢測部件配備高靈敏度的光電傳感器，能夠精準捕捉微弱的熒光信號，并將其轉(zhuǎn)化為電信號，再經(jīng)控制系統(tǒng)處理后，以數(shù)據(jù)形式呈現(xiàn)，實現(xiàn)對 PCR 反應過程中熒光信號的實時監(jiān)測與記錄。

博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的熒光定量PCR儀通過聚合酶鏈式反應實現(xiàn)目標DNA的擴增，借助熒光染料法或熒光探針法實現(xiàn)對PCR產(chǎn)物的實時熒光監(jiān)測，再依靠精密的硬件系統(tǒng)確保反應和檢測的準確性，最終實現(xiàn)對核酸樣本的精準定量分析，為生命科學研究和醫(yī)學診斷提供了強大且可靠的技術(shù)支持。